ASTM F2944-20 Стандартная практика автоматического анализа колониеобразующих единиц (КОЕ) — метод получения изображений и анализа для подсчета и характеристики клеток и колоний в культуре

Стандартный №: ASTM F2944-20
Дата публикации: 2020
Разместил: American Society for Testing and Materials (ASTM)
Последняя версия: ASTM F2944-20

сфера применения: 1.1 Данная практика, при условии понимания ее ограничений, описывает процедуру количественного измерения количества и биологических характеристик колоний, полученных из популяции стволовых клеток или клеток-предшественников, с использованием анализа изображений. 1.2 Данная практика применяется в лабораторных условиях in vitro. 1.3 В данной практике используются: (a) стандартизированные протоколы для получения изображений клеток и колоний, полученных в результате обработки in vitro определенной популяции исходных клеток в определенном поле зрения (FOV), и (b) стандартизированные протоколы для обработки и анализа изображений. . 1.4 Соответствующее поле зрения может быть двумерным или трехмерным, в зависимости от опрашиваемой системы анализа КОЕ. 1.5 Основной единицей измерения результатов анализа является количество колоний, присутствующих в поле зрения. Кроме того, характеристики и подклассификация отдельных колоний и клеток в пределах поля обзора также могут быть оценены на основе существующих морфологических особенностей, свойств распределения или свойств, выявленных с использованием вторичных маркеров (например, методов окрашивания или маркировки). 1.6 Методы визуализации требуют, чтобы изображения соответствующего поля зрения были получены с достаточным разрешением, чтобы обеспечить обнаружение и характеристику отдельных клеток, и в поле зрения, достаточном для обнаружения, различения и характеристики колоний как полноценных объектов для оценки. 1.7 Процедуры обработки изображений, применимые к двух- и трехмерным наборам данных, используются для идентификации клеток или колоний как отдельных объектов в пределах поля зрения. Методы визуализации могут быть оптимизированы для нескольких типов клеток и особенностей клеток с использованием аналитических инструментов сегментации и кластеризации для определения групп клеток, связанных друг с другом близостью или морфологией таким образом, чтобы указывать на общие родственные связи (т. е. клональную экспансию единственная стволовая клетка-основатель или предшественник). 1.8 Характеристики отдельных объектов колонии (клеток на колонию, плотность клеток, размер клеток, распределение клеток, гетерогенность клеток, генотип или фенотип клеток, а также характер, распределение и интенсивность экспрессии вторичных маркеров) информативны о различиях в основных биологических свойствах. клонального потомства. 1.9 В надлежащим образом контролируемых экспериментальных условиях различия между колониями могут быть информативными о биологических свойствах и лежащей в их основе гетерогенности клеток-основателей колоний (КОЕ) в исходной популяции. 1.10 Площадь/объем клеток и колоний, количество и т. д. могут быть выражены как функция площади культуры клеток (квадратные миллиметры) или исходного объема клеточной суспензии (миллилитры). 1.11. Последовательное изображение поля зрения с использованием двух или более оптических методов может оказаться полезным для сбора количественной информации об отдельных клетках или колониях объектов в образце. Кроме того, для отслеживания и проверки процесса потребуется повторное получение изображений одного и того же образца. Следовательно, эта практика требует средств воспроизводимой идентификации местоположения клеток и колоний (центроидов) в пределах области/объема поля зрения с использованием определенной системы координат. 1.12 Для достижения достаточно большого поля зрения (FOV) изображения с достаточным разрешением могут быть получены в виде нескольких полей/фрагментов изображения при большом увеличении, а затем объединены вместе для формирования мозаики, представляющей всю область клеточной культуры. 1.13 Клетки и ткани, обычно используемые в тканевой инженерии, регенеративной медицине и клеточной терапии, регулярно анализируются и анализируются для определения количества, распространенности, биологических особенностей и биологического потенциала исходных стволовых клеток и популяции(й) предшественников. 1.13.1 Общие применимые типы клеток и источники клеток включают, помимо прочего: стволовые клетки и клетки-предшественники млекопитающих; клетки, полученные из взрослых (например, крови, костного мозга, кожи, жира, мышц, слизистой оболочки), клетки, полученные из плода (для 1). Данная практика находится под юрисдикцией Комитета ASTM F04 по медицинским и хирургическим материалам и устройствам и является прямая ответственность Подкомитета F04.43 по клеточным и тканеинженерным конструкциям для TEMP Текущая редакция утверждена 1 апреля 2020 г. Опубликована в июне 2020 г. Первоначально утверждена в 2012 г. Последнее предыдущее издание утверждено в 2012 г. как F2944–12 DOI: 10.1520/F2944– 20. Авторские права © ASTM International, 100 Barr Harbour Drive, PO Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959. США Настоящий международный стандарт был разработан в соответствии с международно признанными принципами стандартизации, установленными в Решении о принципах разработки международных стандартов. Стандарты, руководства и рекомендации, выпущенные Комитетом по техническим барьерам в торговле (ТБТ) Всемирной торговой организации (например, пуповинная кровь, плацентарная/пуповинная жидкость, околоплодные воды); эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (т.е. полученные из внутренней клеточной массы бластоцист); индуцированные плюрипотентные клетки (iPC) (например, перепрограммированные взрослые клетки); культура размноженных клеток; и терминально дифференцированные клетки определенного типа ткани. 1.13.2 Общие применимые примеры зрелых дифференцированных фенотипов, которые имеют отношение к обнаружению дифференциации внутри и между клональными колониями, включают: гематопоэтические фенотипы (эритроциты, лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, макрофаги и т. д.), тканеспецифичные фенотипы взрослых особей. фенотипы клеток-предшественников (отеобласты, хондроциты, адипоциты и т. д.) и других тканей (гепатоциты, нейроны, эндотелиальные клетки, кератиноциты, островки поджелудочной железы и т. д.). 1.14 Количество стволовых клеток и клеток-предшественников в различных тканях можно определить in vitro путем высвобождения клеток из тканей с использованием методов, сохраняющих жизнеспособность и биологический потенциал лежащих в основе стволовых клеток и/или популяции предшественников, и размещения полученных из тканей клеток. клеток в среде in vitro, что приводит к эффективной активации и пролиферации стволовых клеток и клеток-предшественников в виде клональных колоний. Таким образом, истинное количество стволовых клеток и предшественников (истинных колониеобразующих единиц (иКОЕ)) можно оценить на основе количества наблюдаемых колониеобразующих единиц (наблюдаемых колониеобразующих единиц (оКОЕ)) которые сформировались (1-3). 2 (рис. А1.1). Распространенность стволовых клеток и/или предшественников можно оценить на основе количества обнаруженных наблюдаемых колониеобразующих единиц (oCFU), деленного на общее количество проанализированных клеток. 1.15 Автоматизированный подход к получению и анализу изображений (описанный здесь) для подсчета клеток и колоний был проверен и признан обеспечивающим превосходную точность и точность по сравнению с текущим «золотым стандартом» визуального подсчета клеток и колоний, определяемого ручным наблюдателем в светлом поле или флуоресцентный микроскоп с гемоцитометром или без него (4), уменьшающий вариации как внутри, так и между наблюдателями. Несколько групп пытались автоматизировать этот и/или подобные процессы в прошлом (5, 6). Недавние отчеты дополнительно демонстрируют возможность извлечения качественных и количественных данных для колоний различных типов клеток на клеточном и даже ядерном уровне (4, 7). 1.16. Достижения в области программного и аппаратного обеспечения теперь в целом позволяют применять систематические автоматизированные аналитические подходы. Эта развивающаяся технология создает потребность в общем согласии относительно единиц измерения, номенклатуры, определений процессов и аналитической интерпретации, представленных в этой практике. 1.17 Стандартизированные методы автоматического анализа КОЕ открывают возможности повышения ценности и полезности анализов КОЕ в нескольких научных и коммерческих областях: 1.17.1 Стандартизированные методы автоматического анализа КОЕ открывают возможности повышения специфичности методов анализа КОЕ за счет оптимизации обобщаемых протоколов и количественные показатели для конкретных типов клеток и систем анализа КОЕ, которые могут единообразно применяться в разных лабораториях. 1.17.2 Стандартизированные методы автоматизированного анализа КОЕ открывают возможности снижения стоимости анализа колоний во всех аспектах биологических наук за счет увеличения производительности и сокращения требований к рабочему процессу. 1.17.3 Стандартизированные методы автоматического анализа КОЕ открывают возможности для улучшения чувствительности и специфичности экспериментальных систем, стремящихся обнаружить влияние условий in vitro, биологических стимулов, биоматериалов и этапов обработки in vitro на прикрепление, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживаемость стволовых клеток и предшественников. 1.18 Ограничения описаны следующим образом: 1.18.1 Идентификация колоний – Источник клеток/Тип колонии/Вариабельность маркера – Стволовые клетки и предшественники из различных тканевых источников и в разных средах in vitro будут проявлять разные биологические свойства. Таким образом, конкретные средства обнаружения клеток или ядер и используемых вторичных маркеров, а также реализация соответствующих протоколов окрашивания будут различаться в зависимости от системы анализа КОЕ, типа(ов) клеток и опрашиваемых маркеров. Оптимизированные протоколы захвата изображений и анализа изображений для обнаружения клеток и колоний, определения объектов колоний и характеристики объектов колоний будут различаться в зависимости от используемого источника клеток и используемой системы КОЕ. Эти протоколы потребуют независимой оптимизации, характеристики и проверки в каждом приложении. Однако после определения их можно обобщить между лабораториями, а также между клиническими и исследовательскими областями. 1.18.2 Вариативность захвата изображений, вызванная применением инструментов. Описанный выше выбор компонентов получения изображений может отрицательно повлиять на сегментацию клеток и последующую идентификацию колоний, если не принять надлежащие меры. Например, использование ртутной лампы вместо оптоволоконного флуоресцентного источника света или общее смещение оптики может привести к неравномерному освещению или виньетированию мозаичных изображений, составляющих основное изображение с большим полем зрения. Это можно исправить, применив процедуры вычитания фона к каждому фрагменту изображения с большим полем обзора перед сшиванием фрагментов. 1.18.3 Изменения артефактов визуализации, связанные с системой анализа CFU. В дополнение к представлению объектов колоний с уникальными характеристиками, которые необходимо использовать для определения идентификации колонии, каждое изображение из каждой системы CFU может представлять артефакты, не являющиеся клетками и колониями (для например, остатки клеток, ворсинки, аберрации стекла, отражения, автофлуоресценция и т. д.), которые могут затруднить обнаружение клеток и колоний, если их не идентифицировать и не принять меры. 1.18.4 Методы захвата изображения и изменения контроля качества. Изменение качества изображения существенно повлияет на точность и воспроизводимость методов анализа изображений. Изменение фокуса, освещения, регистрации фрагментов, времени экспозиции, гашения и спектрального размытия излучения — все это важные потенциальные ограничения или угрозы для качества и воспроизводимости изображения. 2 Номера, выделенные жирным шрифтом в скобках, относятся к списку ссылок в конце настоящего стандарта. F2944 − 20 2 1.19 Значения, указанные в единицах СИ, следует считать стандартными. Никакие другие единицы измерения в настоящий стандарт не включены. 1.20 Настоящий стандарт не претендует на решение всех проблем безопасности, если таковые имеются, связанных с его использованием. Пользователь настоящего стандарта несет ответственность за установление соответствующих мер безопасности и охраны труда и определение применимости нормативных ограничений перед использованием. 1.21 Настоящий международный стандарт был разработан в соответствии с международно признанными принципами стандартизации, установленными в Решении о принципах разработки международных стандартов, руководств и рекомендаций, изданном Комитетом Всемирной торговой организации по техническим барьерам в торговле (ТБТ).

ASTM F2944-20 Ссылочный документ

ASTM F2998 Руководство по использованию флуоресцентной микроскопии для количественной оценки площади распространения фиксированных клеток*， 2023-10-29 Обновление
ASTM F3294 Стандартное руководство по проведению количественных измерений интенсивности флуоресценции в клеточных анализах с помощью широкопольной эпифлуоресцентной микроскопии
ISO 20391-1 Биотехнология. Подсчет клеток. Часть 1. Общее руководство по методам подсчета клеток.
ISO 20391-2 Биотехнология. Подсчет клеток. Часть 2. Экспериментальный дизайн и статистический анализ для количественной оценки эффективности метода подсчета.

ASTM F2944-20 История

2020 ASTM F2944-20 Стандартная практика автоматического анализа колониеобразующих единиц (КОЕ) — метод получения изображений и анализа для подсчета и характеристики клеток и колоний в культуре
2012 ASTM F2944-12 Стандартный метод тестирования для автоматического анализа колониеобразующих единиц (КОЕ)mdash;Метод получения и анализа изображений для подсчета и характеристики клеток и колоний в культуре