Принцип Тиоловая группа в N-метилацетат-4-меркапто-1,8-нафталимиде оказывает ПЭТ-эффект на флуоресцентное ядро нафталимида, а ее собственная флуоресценция очень слаба; в присутствии акролеина меркаптогруппа N -метилацетат-4-меркапто-1,8-нафталимид и акролеин образуют аддукт посредством реакции присоединения Михаэля, которая подавляет эффект ПЭТ.Аддукт образуется при возбуждении излучаемым светом с длиной волны 380 нм.Сильная флуоресценция, с пиком на длине волны 510 нм.Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации акролеина в тестируемом образце при фиксированных условиях.Он обнаруживается с помощью микропланшет-ридера с детектором флуоресценции и количественно определяется методом внешнего стандарта. Принцип определения акролеина методом флуоресцентного зонда показан на рисунке 1. Рисунок 1 Принцип определения акролеина методом флуоресцентного зонда 5 Реагенты и материалы 5.1 Реагенты Если не указано иное, все реагенты имеют аналитическую степень чистоты, а вода является водой первого сорта, указанной в GB/T6682. 4-Бром-1,8-нафталиндикарбоновый ангидрид (ч.д.а.). Глицин (д.а.ч.). Триэтиламин (ч.д.а.). Этанол (ч.д.а.). Кислота соляная (чда д.а.). п-Толуолсульфоновая кислота (чда д.а.). Метанол (чда д.а.). Натрия сульфида нонагидрат (д.а.ч.). Диметилсульфоксид (ДМСО, чда). Лимонная кислота (чда д.а.). Динатрий гидрофосфат (д.а.ч.). Акролеин (ч.д.а.). 5.2 Приготовление флуоресцентного зонда: 554 мг 4-бром-1,8-нафталендикарбонового ангидрида, 165 мг глицина и 252 мг триэтиламина подвергали взаимодействию при перемешивании на магнитной мешалке с обратным холодильником в этаноле при 80°C в течение 6 ч. После завершения реакции его охлаждают до комнатной температуры и добавляют к реакционному раствору. Регулируют pH с помощью 2,5 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты до тех пор, пока не выпадет белый осадок. Твердое вещество, полученное фильтрованием с отсасыванием, промывают 10 мл воды и этанола соответственно. Белое твердое вещество Получен N-ацетокси-4-бром-1,8-нафталимид. При комнатной температуре 167 мг N-ацетокси-4-бром-1,8-нафталимида и 600 мг нонагидрата сульфида натрия растворяли в 5 мл N,N- диметилформамида и перемешивали в течение 24 ч. После завершения реакции реакционный раствор выливали в 20 мл воды и доводили pH до 2 с помощью 1М водного раствора соляной кислоты, при этом выпадал желтый осадок. После пятикратной промывки водой твердого вещества, полученного фильтрованием под отсасыванием, полученное желтое твердое вещество представляет собой N-ацетокси-4-меркапто-1,8-нафталимид (Pr-ACR), лиофилизированное и помещенное в холодильник с -20°С. Сдержанный. 5.3 Приготовление реагента: pH буфера лимонная кислота-динатрий гидрофосфат составляет 2,2,1 ммоль/л. Растворяют 15,198 г моногидрата лимонной кислоты и 1,955 г додекагидрата гидрофосфата натрия в воде, а затем используют мерную колбу вместимостью 250 мл для доведения объема. Маточный раствор зонда: 2,15 мг Pr-ACR растворяют в 0,5 мл ДМСО для получения маточного раствора зонда с концентрацией 150 ммоль/л. Маточный раствор необходимо приготовить и использовать немедленно. Рабочий раствор зонда: Внесите пипеткой 50 мкл маточного раствора ACR в мерную колбу емкостью 5 мл и доведите объем до 5 мл с помощью буферного раствора, указанного в 4.3.1. Рабочий раствор необходимо приготовить и использовать немедленно. 5.4 Стандартный стандарт акролеина (C3H4O, номер CAS: 107-02-8): чистота более 98,0%. 5.5 Приготовление стандартного раствора: Готовят раствор с концентрацией акролеина 30 мкмоль/л с водой, затем разбавляют и смешивают с водой до получения серии стандартных растворов с концентрациями (0 мкмоль/л, 3 мкмоль/л, 6 мкмоль/л). , 12 мкмоль/л, 18 мкмоль/л, 24 мкмоль/л, 30 мкмоль/л). 6 Приборы и оборудование 6.1 Считыватель микропланшетов (с детектором флуоресценции, Ex250-600 нм, Em280-600 нм). 6.2 96-луночный планшет (черный). 6.3 Дробилка (крупность 30-100 меш). 6.4 Баланс: Чувствительность: 0,00001 г. 6.5 Пипетки (1–10 мкл, 10–100 мкл и 100–1000 мкл). 6.6 Обычная стеклянная посуда. 6.7 Центрифуга (12000 об/мин, 14000×g). 7 Этапы испытаний 7.1 Нанесение квазикривой Пипеткой перенесите 100 мкл рабочего раствора зонда из 4.3.3 в 96-луночный планшет, а затем добавьте 50 мкл стандартного раствора акролеина различных концентраций из 4.5, чтобы получить концентрацию акролеина 0 мкмоль/ л и 1 мкмоль соответственно. /л, 2 мкмоль/л, 4 мкмоль/л, 6 мкмоль/л, 8 мкмоль/л, 10 мкмоль/л, хорошо встряхнуть и реагировать при 25°C в течение 90 минут, затем поместить в считывателе микропланшетов для обнаружения флуоресценции и считайте длину волны при 510 нм. Значение интенсивности флуоресценции при (длина волны возбуждения составляет 380 нм) и спектр ее излучения флуоресценции показаны в Приложении А. 7.2 Подготовка проб: Добавьте 1 г измельченного пищевого порошка в центрифужную пробирку емкостью 15 мл, добавьте 5 мл воды, равномерно перемешайте и проведите ультразвуковую экстракцию в течение 20 минут, затем центрифугируйте со скоростью 10 000 об/мин в течение 20 минут, чтобы собрать надосадочную жидкость. Осажденный материал в центрифужной пробирке дважды экстрагировали 2 мл воды в соответствии с описанной выше операцией. Супернатанты, полученные в результате трех экстракций, объединяли и объем доводили до 10 мл для последующего использования. 7.3 Определение образцов: Внесите 100 мкл рабочего раствора зонда, указанного в 4.3.3, в черный 96-луночный планшет, затем добавьте 50 мкл раствора для экстракции образца, указанного в 6.2, хорошо встряхните и поместите его при 25°C для реакции. За 90 минут до использования микропланшетного ридера.Для обнаружения флуоресценции считайте значение интенсивности флуоресценции при длине волны 510 нм (длина волны возбуждения 380 нм) и повторите каждую обработку три раза. 7.4 Холостой эксперимент проводят в соответствии с указанными выше условиями и методикой измерений, за исключением того, что пробу не взвешивают. 8 Обработка данных испытаний. Содержание акролеина в пробе рассчитывают по следующей формуле: ……………(1) Где: Х — — Содержание акролеина в пробе, мг /кг (мг/кг); 56,06 - молярная масса акролеина; C - молярная массовая концентрация акролеина в растворе пробы, микромоль/л (мкмоль/л); V - общий объем испытуемой пробы, миллилитры. (мл) ;m — — Масса образца, грамм (г). Результаты расчета выражаются как среднее арифметическое трех независимых результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, и в результатах сохраняются три значащие цифры. 9 Точность 9.1 Общие положения Точность этого документа определяется в соответствии с положениями GB/T6379.2, а значения повторяемости и воспроизводимости рассчитываются с уровнем достоверности 95%. 9.2 Повторяемость В условиях повторяемости абсолютная разница между полученными результатами двух независимых измерений не должна превышать 10 % среднего арифметического. 9.3 Воспроизводимость В условиях воспроизводимости абсолютная разница между полученными результатами двух независимых измерений не должна превышать 10 % среднего арифметического значения. 10 Отчет об испытаниях В отчете об испытаниях должны быть отражены как минимум следующие аспекты:
——Объект испытания;
——Используемые стандарты;
——Используемые методы;
——Результаты;
——— Наблюдаемые аномальные явления;
——Дата испытания. Приложение А (справочное) Диаграмма спектра излучения флуоресценции
T/GDBK 007-2023 История
2023T/GDBK 007-2023 Быстрое определение акролеина в выпечке — метод считывания микропланшетов (метод флуоресцентного зонда).