T/SDAA 0045-2021
Обнаружение Pasteurella multocida методом ПЦР (Англоязычная версия)

Стандартный №

T/SDAA 0045-2021

язык

Китайский, Доступно на английском

Дата публикации

2021

Разместил

Group Standards of the People's Republic of China

Последняя версия

T/SDAA 0045-2021

сфера применения

Метод ПЦР для обнаружения Pasteurella multocida 1. Область применения В настоящем документе описан метод ПЦР для обнаружения Pasteurella multocida у свиней. Этот метод подходит для выявления Pasteurella multocida у свиней. 2 Нормативные ссылки Содержание следующих документов представляет собой основные положения настоящего документа посредством нормативных ссылок в тексте. Среди них для датированных справочных документов к настоящему документу применяется только версия, соответствующая дате; для недатированных справочных документов к данному документу применяется последняя версия (включая все изменения). NY/T541 Техническая спецификация для сбора, хранения и транспортировки образцов ветеринарной диагностики. Нуклеиновая кислота ДНК бацилл используется в качестве матрицы для амплификации конкретных целевых фрагментов ДНК. Амплифицированные фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле, и о результатах судили по размеру полос ДНК. 4 Реагенты или материалы Если не указано иное, все используемые реагенты имеют аналитическую степень чистоты. 4.1 Вода: GB/T6682, класс I. 4,25% пластинка с овечьей кровью 4,3 Окрашивание по Граму 4,42 × TaqMasterMix 4,5 DNAMarkerDL2000 4,6 Агароза 4,7 TAE-буфер 4,84 Нетоксичный краситель нуклеиновой кислоты SGreenPlus T/SDAA0045-20215 Оборудование 5.1 Бокс биологической безопасности: оснащен сверхвысокоэффективным воздушным фильтром ULPA. 5.2 Высокоскоростная центрифуга с охлаждением: скорость не ниже 12000 об/мин. Прибор 5.3PCR: максимальная скорость нагрева и охлаждения составляет 4°C/с, а диапазон температур составляет 4°C~99°C. 5.4 Гелевый имидж-сканер: разрешение изображения составляет не менее 5 миллионов пикселей, а чувствительность позволяет обнаруживать двухцепочечную ДНК, окрашенную EB, с концентрацией менее 20 пг. 5.5 Прибор для передачи ультрафиолетового излучения: длина волны излучаемого источника ультрафиолетового света составляет 302 нм. 5.6 Прибор для электрофореза, диапазон постоянного выходного напряжения: 3～300 В, диапазон постоянного выходного тока: 1～400 мА, диапазон постоянной выходной мощности: 1～120 Вт. 6 Пробы должны быть собраны и сохранены в соответствии с правилами NY/T541. 7 Этапы испытаний 7.1 Выделение и чистая культура бактерий 7.1.1 В боксе биологической безопасности инокулируют асептически собранную сердечную кровь больных животных непосредственно на чашку крови овцы с помощью инокуляционной петли. Для собранных легких, печени или селезенки прижигают поверхность легких, печени или селезенки раскаленным лезвием от пламени спиртовки и стерильными хирургическими ножницами прорезают небольшое отверстие на прижженном месте. Ожгите прививочную петлю пламенем спиртовки и после охлаждения вставьте прививочную петлю из небольшого отверстия больного материала в легкое и т. д., возьмите небольшое количество ткани и инокулируйте штрихами на 5% пластинка с кровью овцы. После инокуляции чашки метили и помещали в инкубатор, инкубировали при 37°С в течение 24 часов и наблюдали за размером, формой и гемолизом колоний. 7.1.2 Колония Pasteurella multocida округлой формы, с аккуратными краями, гладкой поверхностью, напоминающей слизь, размером около 1–1,5 мм. Форма колонии указана в Приложении А.1. 7.2 Окраска по Граму и микроскопическое исследование 7.2.1 Возьмите чистое предметное стекло, с помощью крючка для инокуляционной петли возьмите кольцо стерильного физиологического раствора и нанесите на предметное стекло водную пленку диаметром 1 см. Возьмите одну колонию и равномерно размажьте ее пленкой воды, высушите при комнатной температуре и зафиксируйте пламенем. Выполните окраску по Граму. 7.2.2 Добавляют по каплям раствор красителя кристаллический фиолетовый, окрашивают в течение 1–2 мин, медленно промывают проточной водой и высушивают; 7.2.3 Добавляют по каплям раствор йода Грама, окрашивают в течение 1–2 мин, медленно промывают проточной водой и высушивают; 7.2 .4 Добавьте 95% этанол, обесцветьте в течение 10–30 с, медленно промойте проточной водой и высушите T/SDAA0045-20217.2.5 Добавьте по каплям раствор для контрастного окрашивания, контрастируйте в течение 1 минуты, медленно промойте проточной водой и высушите естественным путем. 7.2.6 Микроскопическое исследование Pasteurella multocida является грамотрицательным, Brevibacterium или кокком, а морфология бактерий показана в Приложении А.2. 7.3 ПЦР-обнаружение 7.3.1 Подготовка матрицы ДНК бактериального генома осуществляется в соответствии с NY/T564- 2016 г. Подготовлено в соответствии с п. 4.4.4. 7.3.2 ПЦР-амплификация 7.3.2.1 Праймеры В соответствии с последовательностью гена 16S рРНК Pasteurella multocida (см. Приложение А.3) спроектируйте пару праймеров и синтезируйте их коммерчески. Последовательность праймеров см. в Приложении Б.1. 7.3.2.2 Реакционная система ПЦР Реакция ПЦР Система представляет собой систему объемом 25 мкл, см. Приложение B.2 7.3.2.3 Условия реакции ПЦР Центрифугируйте реакционную пробирку с образцом при 2000 об/мин в течение 1 мин и поместите ее в прибор для амплификации ПЦР для амплификации. Условия реакции ПЦР были следующими: предденатурация при 94°С в течение 5 мин, денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 53°С в течение 30 с, удлинение при 72°С в течение 30 с, амплификация в течение 32 циклов, финал. удлинение при 72°С в течение 10 мин и реакция завершилась. В то же время были установлены положительный (стандартный штамм) и отрицательный (стерильная вода) контроли Pasteurella multocida. Продукт ПЦР-амплификации подвергали электрофорезу в 1,5% агарозном геле и размер амплифицированной полосы ДНК исследовали с помощью УФ-трансиллюминатора или гель-визора. 7.4. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле следует проводить в соответствии с правилами NY/T564-20164.4.6. 7.5 Оценка результата 7.5.1 Условия проведения теста основаны на размере полосы ДНК в DL2000DNAMarker. Когда положительный контроль амплифицирует фрагмент размером около 355 пар оснований, а отрицательный контроль не амплифицирует этот фрагмент, результат теста устанавливается. Результаты электрофореза нуклеиновых кислот показаны в Приложении B.3. 7.5.2 Положительное заключение Если условия 7.5.1 соблюдены и из тестируемого образца амплифицируется фрагмент размером около 355 п.н., определяют, что тестируемая бактерия представляет собой Pasteurella. мультоцида. T/SDAA0045-20217.4.5.3 Если отрицательное заключение соответствует условиям 7.5.1 и тестируемый образец не амплифицирует фрагмент размером приблизительно 355 п.н., определяют, что тестируемая бактерия не является Pasteurella multocida.

T/SDAA 0045-2021 История

• 2021 T/SDAA 0045-2021 Обнаружение Pasteurella multocida методом ПЦР