5. Технические требования: Инокуляцию следует проводить в асептических условиях во избежание контаминации различными бактериями. Регулярный осмотр Во время культивирования бактериальных штаммов регулярно проверяйте температуру и влажность инкубатора, в котором культивируются бактериальные штаммы, проверяйте ватные тампоны, крышки и питательную среду культуральных сосудов на предмет роста плесени. При обнаружении каких-либо отклонений немедленно выньте пробирку и повторно очистите ее.После культивирования заполните пробелы, проверьте наличие клещей и других вредителей под маломощным препаровальным микроскопом и своевременно устраняйте их при обнаружении. 6 Методы и процедуры Бактерии обычно делят на 3 уровня. Виды уровня 1 также называются материнскими видами или видами из пробирки. Материнский вид можно получить путем выделения ткани или выделения спор. Виды уровня 2, также называемые оригинальными видами, представляют собой штаммы, полученные путем помещения мицелия материнского вида в культуральную среду из опилок. Виды уровня 3 также называются культивируемыми видами, которые представляют собой штаммы, полученные путем размножения исходных видов. Они используются непосредственно для производства, поэтому их также называют производственными видами. После непрерывного размножения и размножения материнских видов - исходных видов - культивируемых видов количество мицелия будет увеличиваться и становиться все сильнее и сильнее. Если такой мицелий запустить в производство, можно вырастить отличные плодовые тела. Получение маточного семени 6.1.1 Приготовление маточной семенной среды Для приготовления маточной семенной среды используйте среду, обогащенную PDA. Формула: 200 г картофеля, 20 г глюкозы, 20 г агара, KH2PO41,5~2 г, MgSO40,5~1 г, 10 г пептона, вода.1000мл. Способ приготовления: Очистите 200 г картофеля, удалите ростки, нарежьте его небольшими полосками и положите в алюминиевую кастрюлю. Добавьте 1000 мл воды и 20 г скорлупы хлопковых семян. Варите около 20-30 минут, пока картофель не станет хрустящим, но не гнилым. Используйте 6 - Профильтровать через 8 слоев марли, перелить отфильтрованный сок в кастрюлю, добавить 20 г глюкозы, 1,5–2 г KH2PO4, 0,5–1 г MgSO4, 10 г пептона, долить воды до 1000 мл, добавить агар, чтобы он расплавился, и распределить его. в пробирки в горячем состоянии.Используйте диаметр пробирки 2см, оптимальная длина 20см. Приготовленную культуральную среду разложить по пробиркам с помощью воронки. Горловину и стенки пробирки заполнить антипригарной питательной средой и закрыть резиновыми пробками или ватными тампонами. Свяжите каждые 7 пробирок в пучок, оберните горлышко пробирки крафт-бумагой, поставьте ее вертикально в стерилизационный сосуд и стерилизуйте при температуре 121°C и давлении 0,11~0,15 МПа в течение 30 минут. После того, как питательная среда остынет до 60~70°C. C, поместите его в наклонную плоскость. Длина предпочтительно должна составлять около 2/3 длины трубы и использоваться для охлаждения. 6.1.2 Выделение бактериальных штаммов и культура в пробирках Методы выделения бактериальных штаммов включают метод выделения спор, метод выделения ткани и метод выделения мицелия. Способ выделения спор - использовать свежие, свободные от бактериальной обсемененности годичных ушных вкладышей, желательно черные, толстые и крупные, несколько раз промыть их стерильной водой, вентральную сторону ушных вкладышей подвешивать шелковой нитью вниз. нить, а другой конец подвешивают на емкость.Горловину колбы Эрленмейера с питательной средой закрывают ватной пробкой, споры получают и культивируют в мицелий в инкубаторе при 25-28°С. Метод разделения тканей заключается в использовании высококачественных ушных вкладышей, протирании поверхности ватными шариками с 75% спиртом 2–3 раза, обертывании ушных вкладышей спиртовой ватой примерно на 2 минуты и отрезании примерно 0,2 квадратных сантиметра от сухожилия. свободная часть основания уха. В стерильных условиях поместите его в наклонную культуральную среду пробирки и культивируйте при температуре от 25 до 28°C для выращивания мицелия. Метод выделения мицелия – это метод отделения мицелия от древесных сегментов черного гриба с целью получения штаммов бактерий. Вырежьте кусок дерева размером со спичечную головку, простерилизуйте его, в стерильных условиях вставьте в наклонную часть пробирки, а затем культивируйте при 25-28°С для выращивания мицелия. Успешно выделенные материнские виды в пробирке также можно размножить и размножить на наклонной среде пробирки от 1 до 3 раз.Этот процесс называется переносом пробирки или расширением пробирки, также называемым субкультурой. Обычно одно материнское семя можно превратить в 30–40 материнских семян для удовлетворения производственных потребностей. Перенос культуры в пробирке: Когда температура культуральной среды упадет ниже 30°C, инокулируйте ее в стерильной комнате. Используйте инокуляционный крючок, чтобы быстро и аккуратно вставить бактерии в пустую наклонную культуральную среду. При вырезании штаммов выбирайте часть, находящуюся далеко от исходных старых штаммов. Как правило, наибольшую активность имеют два конца культуральной среды. Размер блока штамма составляет от 1 до 2 мм. Чем меньше блок, тем более последовательным возраст бактерий. При отделении штаммов и переносе пробирок для посева асептические операции должны выполняться на чистом рабочем столе, чтобы предотвратить контаминацию различными бактериями. Через несколько дней после отделения или переноса на склоне пробирки вырастут белые пушистые черные гифы гриба. Примерно через 10 дней культивирования по всему склону может вырасти мицелий, который является материнским семенем. 6.1.3 Материнская культура семян Условия маточной культуры семян должны культивироваться в инкубаторе с постоянной температурой (26±1)°С в темноте. Мицелий прорастет примерно через 10 дней. В течение этого периода необходимо регулярное наблюдение для выявления зараженные или мертвые материнские семена. Рост мицелия сильный, белый, однородный, без бактериального загрязнения, что является хорошим штаммом. Приготовление исходной среды 6.2.1 Приготовление питательной среды (1) Формула среды. Средняя формула состоит из 78% шелухи хлопкового семени, 20% пшеничных отрубей, 1% сахарозы и 1% гипса. (2) Способ приготовления. Лузгу семян хлопчатника, пшеничные отруби и гипс равномерно перемешать, а затем добавить воду до достижения влажности культурного материала около 60%. Метод измерения заключается в том, чтобы плотно удерживать культуральную среду руками, при этом между пальцами должен оставаться небольшой водяной знак, но не капать. (3) Средний розлив и упаковка. Бутылки с инокулятом используются для производства сырья. После приготовления питательной среды ее можно поместить в колбу Эрленмейера, заполнить до уступа колбы и разровнять поверхность материала. Культуральный материал следует затягивать и ослаблять в бутылке, а в середине деревянным шилом проделывать отверстие. Протрите горлышко бутылки изнутри и снаружи и закройте его хлопчатобумажной/резиновой пробкой. (4) Средняя стерилизация. Исходный вид разливают по бутылкам, а затем помещают в железные корзины или пластиковые корзины для стерилизации. Метод стерилизации использует стерилизацию паром под высоким давлением. При использовании паровой стерилизации высокого давления кастрюлю стерилизуют под давлением 0,15 МПа (температура в кастрюле 127°С) в течение 1,5 часов. 6.2.2. Инокуляция исходных семян. Исходные семена представляют собой бактериальный штамм, полученный путем размножения материнского штамма на исходную культуральную среду. После того, как стерилизованный инокуляционный флакон или пакет перемещают на чистый верстак или в инокуляционную комнату для инокуляции, после того, как температура материала упадет ниже 30°C. Перед вакцинацией переместите оборудование и предметы для вакцинации в место вакцинации. Эти принадлежности и предметы в основном включают ложки для вакцинации, пинцеты, спиртовые лампы, спиртовые ватные шарики, бактериальные штаммы и пакеты для прививок. После того, как предметы убраны, используйте ультрафиолетовый свет или аэрозольное дезинфицирующее средство для фумигации и дезинфекции и подождите 40 минут перед использованием. При прививке сначала зажгите спиртовую лампу, протрите инструменты для инокуляции, бактериальную поверхность и руки инокулятора 75% спиртом, затем сожгите иглу для прививки, пинцет и бактериальные ватные тампоны на огне для стерилизации, а затем сожгите Аккуратно вытащите хлопчатобумажную/резиновую пробку из горлышка (флакона) и поднесите ее по диагонали к огню, чтобы приступить к формальной вакцинации. При инокуляции исходных семян используйте прививочную иглу, чтобы разделить наклон каждого материнского семени на 4-5 частей, и вставьте один сегмент в каждую бутылку с исходной культуральной средой; при инокуляции культивированных семян используйте пинцет, чтобы вставить небольшую часть исходного семени в каждую бутылку с культуральной средой.Семена, то есть каждую бутылку с оригинальными семенами, обычно можно использовать для выращивания 30-40 бутылок или 40-50 бутылок. 6.2.3 Перед использованием исходное место культивирования также должно быть фумигировано и продезинфицировано аэрозольными дезинфицирующими средствами. (1) Температура культуры: Обычно при температуре 22–25 °C бутылку можно полностью вырастить за 25–60 дней. (2) Влажность культуры: относительная влажность в помещении поддерживается на уровне 60–70 %, а воздух в помещении всегда поддерживается свежим, чтобы способствовать росту мицелия. Если влажность воздуха в помещении слишком высокая, посыпьте землю известковым порошком, чтобы снизить влажность и предотвратить размножение вредителей и болезней. (3) Поместите флаконы с штаммами вертикально: поскольку вставленные блоки штаммов еще не выросли и не зафиксировались, если их перевернуть, блоки легко упадут в сторону флакона, что повлияет на прорастание штаммов. Если количество полученных бактериальных штаммов велико, мицелий следует прорастить и запечатать, а затем сложить их вверх дном, чтобы полностью использовать пространство. (4) Проверка и удаление примесей: С самого начала прорастания бактерий и герметизации колонизации необходимо часто проверять, нет ли какого-либо загрязнения посторонними бактериями. Если обнаружены посторонние бактерии, их следует обнаружить вовремя. Как правило, Работу по проверке продолжают до тех пор, пока мицелий не покроет всю поверхность питательной среды. (5) Соблюдайте чистоту и гигиену: Соблюдайте чистоту и гигиену внутри и снаружи помещения для выращивания. В то же время каждые 7-10 дней в течение периода выращивания распыляйте 1% дихлофос или другую инсектицидную жидкость в помещении и на открытом воздухе, а также на пробку бутылки. для предотвращения появления вредителей. После того, как штаммы выращены, храните их в сухом, чистом, защищенном от света месте при низкой температуре до момента использования. Получение культивируемых видов. Культивируемые виды представляют собой штаммы, полученные путем размножения исходного вида на культуральной среде сорта. 6.3.1 Приготовление питательной среды для культивируемых видов Рецептура и метод приготовления питательной среды для культивируемых видов такие же, как и для исходных видов, но культивируемые виды обычно производятся в полиэтиленовых пакетах, а полипропиленовые пакеты подходят для пара высокого давления. стерилизация. Размер сумки 36 см х 16,2 см х 0,005 см. При расфасовке обеспечьте надлежащую герметичность.После расфасовки используйте упаковочную машину, чтобы расфасовать и вставить инокуляционный стержень. При упаковке в мешки следует обращаться с осторожностью, чтобы предотвратить попадание песка или мусора в мешки и их загрязнение. После расфасовки питательной среды ее помещают в пластиковый лоток и помещают в большой автоклав при давлении 0,14 МПа и температуре 121°С на 3,5 часа. 6.3.2 Инокуляция культивируемых видов Метод инокуляции культивируемых видов соответствует методу инокуляции исходных видов. 6.3.3 Выращивание культивируемых видов Выращивание культивируемых видов соответствует исходным видам, но не подходит для расширения культуры культивируемых видов. Процедуры асептической инокуляции Асептические операции обычно выполняются на чистом рабочем столе или в инокуляционной комнате. Когда рабочая нагрузка небольшая, используется чистый рабочий стол. Когда рабочая нагрузка велика, например, при изготовлении культивированных семян, ее необходимо выполнять в инокуляционном отделении. комната. Этапы работы следующие: 6.4.1 Инструкции по использованию сверхчистого рабочего стола Сначала очистите сверхчистый рабочий стол и комнату для инокуляции и поместите в них питательную среду, бактериальные штаммы и оборудование для инокуляции. Используйте ультрафиолетовый свет для стерилизации ультрачистого рабочего стола в течение 30 минут. Бактерии необходимо накрыть газетой, чтобы ультрафиолет не убивал бактерии. Для фумигации и дезинфекции прививочной комнаты использовать аэрозольный дезинфицирующий порошок из расчета 1 пакетик (5 грамм) на кубический метр помещения, поместить в емкость, поджечь и хранить более 40 минут. Протрите руки ватой с 75% спиртом. Зажгите спиртовку, сожгите и простерилизуйте инструменты для вакцинации перед началом вакцинации. Во время инокуляции необходимо соблюдать асептические условия.После инокуляции культуральную среду ее перемещают в культуральную комнату для культивирования. 6.4.2 Инструкции по использованию комнаты для прививок ① За час до каждого использования переместите необходимые предметы в комнату для прививок, поместите их в определенное положение и проверьте, насколько они укомплектованы. После опрыскивания инокуляционной и буферной комнаты 5% раствором карболовой кислоты включите ультрафиолетовую лампу на 40 минут; ② Выключите ультрафиолетовую лампу и через 20 минут войдите в буферную комнату, наденьте стерильную рабочую одежду, обувь, маски и 2 Замочите руки в % мыле с карболовой кислотой на 2 минуты: ③ Войдите в комнату для прививок и распылите 5 % раствор карболовой кислоты на верхнюю часть рабочего стола и близлежащую землю. ④ Перед прививкой протрите руки ватными шариками с 75% спиртом, а затем выполните различные операции на пламени как обычно. Во время работы движения должны быть легкими и подвижными, чтобы свести к минимуму колебания воздуха, и оба человека должны молчаливо сотрудничать во время работы. Использованные спички и макулатуру не бросать на землю, а складывать в специальные контейнеры; ⑤ После окончания работы вовремя вынимать прививочные материалы, затем убирать со стола, выносить отходы из помещения, а затем распылять 5% карболовой кислоты или откройте Облучайте УФ-лампой в течение получаса; ⑥ Если ватный тампон загорелся во время вакцинации, крепко держите его руками, чтобы потушить, или потушите влажной тряпкой. Не задуйте его ртом, чтобы не расширять пламя. Если культуральный или бактериальный контейнер разбит и рассыпан, следует немедленно использовать тряпку, смоченную 5% раствором карболовой кислоты, очистить ее, а затем перед продолжением операции протереть руки спиртовым ватным тампоном.
T/SYJ 0003-2023 История
2023T/SYJ 0003-2023 Технический регламент на производство твердых штаммов черного гриба