Принцип: После обезжиривания образца н-гексаном его экстрагируют 20% раствором метанола в воде. Экстракт выпаривают досуха при пониженном давлении, а затем повторно растворяют. Раствор образца используется при мониторинге множественных реакций (MRM). режим высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометра.Определение, количественный метод внешнего стандарта. 5 Реагенты и материалы 5.1 Реагенты Если не указано иное, все реагенты имеют аналитическую степень чистоты, а вода является водой первого сорта, указанной в GB/T6682. Метанол (хроматографически чистый). н-гексан (д.а.ч.). Муравьиная кислота (хроматографически чистая). Формальдегид (ч.д.а.). Глиоксаль (глиоксаль, ГО, ч.д.а.). γ-аминомасляная кислота (д.а.ч.). 5.2 Приготовление реагента из метанол/водного раствора (20%): 50 мл метанола (5.1.1) вносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят до нужного объема водой. Водный раствор муравьиной кислоты (0,1%): Пипеткой вносят 0,25 мл муравьиной кислоты (5.1.3) в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят объем водой до метки. 5.3 Стандартный стандарт аддукта γ-аминомасляной кислоты-глиоксаль-формальдегида (C11H16N2O4, номер CAS: 805228-41-5): чистота более 98,0%. 5.4 Приготовление стандартного раствора По мере необходимости готовят раствор аддукта γ-аминомасляной кислоты с глиоксаль-формальдегидом концентрацией 10 мг/л с водой и разбавляют его водой до получения серии стандартных растворов с концентрацией (100 мкг). /л, 500 мкг/л, 1000 мкг/л, 2000 мкг/л, 3000 мкг/л, 4000 мкг/л). 6 Приборы и оборудование 6.1 Жидкостный хроматограф/тройной квадрупольный масс-спектрометр, оснащенный источником ионов электрораспыления (ESI). 6.2 Дробилка (дисперсность: от 30 до 100 меш). 6.3 Аналитические весы, чувствительность 0,0001 грамм. 6.4 Аналитические весы, чувствительность 0,00001 грамм. 6.5 Центрифуга высокоскоростная (12000 об/мин, 14000×g). 6.6 Вортексор (300–3000 об/мин). 6.7 Общая лабораторная посуда. 7 Этапы испытания 7.1 Подготовка пробы Взвесьте 3 г измельченного образца (пропущенного через сито 60 меш) в центрифужную пробирку емкостью 50 мл, добавьте 10 мл н-гексана, чтобы покрыть образец, встряхивайте в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение 10 минут. минут, повторите 3 раза, чтобы полностью удалить смазку, поместите в вытяжной шкаф для испарения остатков н-гексана. Добавьте 15 мл 20% раствора метанола в воде в центрифужную пробирку, перемешайте на вортексе в течение 5 минут, а затем центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение 10 минут, чтобы собрать надосадочную жидкость. Повторите этот процесс дважды. Выпарите супернатант досуха при пониженном давлении, добавьте 20% смеси метанола/воды для растворения и доведите объем до 5 мл. Отфильтруйте нейлоновым фильтром 0,22 мкм и измерьте содержание γ-аминомасляной кислоты-глиоксаля-формальдегида в образце, используя режим мониторинга множественных реакций (MRM) ВЭЖХ-МС/МС. 7.2 Хроматографическое определение 7.2.1 Стандартные условия высокоэффективной жидкостной хроматографии a) Хроматографическая колонка: колонка с октадецилсилановым силикагелем (C18) Aq, размер насадочных частиц 5,0 мкм, длина колонки 250 мм, внутренний диаметр 4,6 мкм или другая эквивалентная хроматографическая колонка; b ) Подвижная фаза: Фаза A представляет собой раствор, содержащий 0,1% муравьиной кислоты/воды, фаза B представляет собой метанол, степень градиентного элюирования: от 0 до 2 минут, от 5% B до 95% B; от 2 до 8 минут, от 95% B до 95% B ;8мин～10мин, 95%B～5%B; 10мин～18мин, 5%B. в) Скорость потока: 0,4 мл/мин г) Температура колонки: 40 ℃. д) Объем инъекции: 0,5 мкл. 7.2.2 Стандартные условия масс-спектрометрии а) Режим ионизации: ионизация электрораспылением положительных ионов (ESI+) b) Режим ионного сканирования: режим мониторинга множественных реакций (MRM) c) Капиллярное напряжение: 4000 В d) Напряжение декластеризации: 50 В e) Осушающий газ Температура: 300 ℃ f) Расход осушающего газа: 10 л/мин g) Давление распыляющего газа: 50 фунтов на квадратный дюйм h) Диапазон ионов мониторинга: m/z50~800. i) Качественные и количественные ионы приведены в Таблице 1: Таблица 1 Оптимизированные параметры напряжения аддукта γ-аминомасляная кислота-глиоксаль-формальдегид Тип аддукта Напряжение столкновения ионной пары (эВ) γ-аминомасляная кислота-глиоксаль-формальдегид 241/155a 241/69 241/87 -16 -22 -22 a – количественный ион 7.2.3 Построение стандартной кривой Возьмите стандартный раствор аддукта γ-аминомасляной кислоты, глиоксаль-формальдегида (100 мкг/л, 500 мкг/л, 1000 мкг/л , 2000 мкг/л, 3000 мкг/л, 4000 мкг/л), измеренные в соответствии с эталонными хроматографическими условиями (7.2.1), при этом массовая концентрация аддукта в стандартном ряду отложена по оси абсцисс, а площадь пика – по оси ординат и рисуется стандартная кривая. 7.2.4 Определение проб: Вводят по 0,5 мкл раствора пробы и стандартного раствора в жидкостный хроматограф для анализа. Оценивают время удерживания целевого пика стандартного раствора и рассчитывают содержание измеряемого вещества в образец на основе площади пика. Полная ионная хроматограмма и масс-спектр аддукта приведены в Приложении А. 7.2.5 Холостой эксперимент проводят в соответствии с указанными выше условиями и методикой измерений, за исключением того, что пробу не взвешивают. 8 Содержание аддукта γ-аминомасляной кислоты-глиоксаль-формальдегида в образце обработки данных испытаний рассчитывают по формуле (1): ……………(1) Формула Среда: х——Содержание аддукта γ-аминомасляной кислоты с глиоксальформальдегидом в пробе, микрограмм/кг (мкг/кг); C——Концентрация аддукта в пробе, мкг/л (мкг/л); V ——общий объём испытуемой пробы, миллилитры (мл); D——коэффициент разбавления пробы; M——масса взвешиваемой пробы, граммы (г). Результаты расчета выражаются как среднее арифметическое трех независимых результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, и в результатах сохраняются три значащие цифры. 9 Точность 9.1 Общие положения Точность этого документа определяется в соответствии с положениями GB/T6379.2, а значения повторяемости и воспроизводимости рассчитываются с уровнем достоверности 95%. 9.2 Повторяемость В условиях повторяемости абсолютная разница между полученными результатами двух независимых измерений не должна превышать 10 % среднего арифметического. 9.3 Воспроизводимость В условиях воспроизводимости абсолютная разница между полученными результатами двух независимых измерений не должна превышать 10 % среднего арифметического значения. 10 Отчет об испытаниях В отчете об испытаниях должны быть отражены как минимум следующие аспекты:
——Объект испытания;
——Используемые стандарты;
——Используемые методы;
——Результаты;
——— Наблюдаемые аномальные явления;
——Дата испытания. Приложение А (Информативное приложение) Суммарная ионная хроматограмма и масс-спектр аддукта γ-аминомасляной кислоты с глиоксалем и формальдегидом.
T/GDBK 006-2023 История
2023T/GDBK 006-2023 Метод обнаружения аддукта γ-аминомасляной кислоты-глиоксаль-формальдегида в выпечке — Высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-спектрометрия.